什么是冷冻电子显微镜？

冷冻电子显微镜（cryo-EM）越来越多地被用作以分子分辨率研究蛋白质组装体，病毒和细胞结构的主流技术。本文重点介绍冷冻电镜的不同方面，包括其优缺点，应用，冷冻电镜和电子显微镜（EM）技术之间的差异，以及最近涉及冷冻电镜技术的研究。

什么是冷冻电镜？
低温电镜被称为电镜的一种形式，其中透射电子显微镜（TEM）用于在低温条件下获得辐射敏感标本的图像。术语 cryo-EM 通常用于几种实验方法，例如单颗粒冷冻电镜、电子晶体学和冷冻电子断层扫描。

每种冷冻电镜方法都可以单独使用，也可以在混合方法中使用，其中从冷冻电镜获得的信息与从核磁共振（NMR）光谱和X射线晶体学方法获得的互补信息合并。目前，冷冻电磁脉冲机已经变得更加容易获得和使用，并用于成像生物标本，如细菌，沉降冷冻细胞和完整的组织切片。

EM和Cryo-EM之间的区别
传统的EM方法使用标本的染色，脱水和化学固定来获得其图像。有机物和电子之间的相互作用会广泛破坏EM中的生物标本。

同时，cryo-EM保留了标本的天然水合状态，因为该技术不需要额外的方法来成像标本。

电子照射会破坏标本内的化学键，从而导致自由基的产生，进一步造成二次损伤。虽然低电子剂量可以通过最小化辐射损伤来保存标本，但这种低剂量会导致噪声图像。

Cryo-EM可以有效地解决这个问题，因为该技术中的成像是使用冷冻样品进行的，这些样品保持在液氦或液氮温度下，从而减少了电子辐照对标本的不利影响。

生物标本在玻璃状冰层中迅速玻璃化，然后在液氦和/或液氮温度下成像。在氮气温度下，辐射损伤大大减少，这允许使用更高的电子剂量来获得具有良好信噪比的图像。液氮和氦气也可用于通过冷冻电镜方法在近分子水平上获得样品的三维（3D）重建。

冷冻电镜的优缺点
冷冻电镜技术不需要晶体，适用于蛋白质及其大分子量复合物的成像，以及膜蛋白的结构分析。此外，该技术保留了生物样品的功能状态和天然活性，并解决了其他技术（如X射线晶体学）无法解析的结构。

然而，冷冻电镜对于非常小的蛋白质成像是无效的，并且需要相当长的时间来生成样品图像。此外，该技术需要非常高的样品均匀性，这增加了获得柔性蛋白质高分辨率图像的难度。此外，冷冻电镜的当前分辨率不足以进行药物研究和开发，因为通过该技术获得的图像在某些情况下具有较低的信噪比。

冷冻电镜方法的主要应用
冷冻电子断层扫描用于基于一系列图像创建大分子组件的3D结构，每个图像相对于入射电子束方向以不同的倾斜度获得。然而，较厚的标本（如真核细胞或大型病毒）的成像通常使用成像过滤器进行，该过滤器通过去除非弹性散射电子来增强对比度。

然后，这些图像通过计算组合以生成断层扫描图，这些断层扫描图主要是标本的3D图像。从这些断层扫描研究中得出了一些见解，例如膜蛋白组装体的横向排列和细菌细胞骨架的组织。冷冻电子断层扫描的其他应用包括研究不同的细胞骨架和丝状组件以及薄哺乳动物细胞区域的成像。

单颗粒分析是最常用的冷冻电镜技术。在单颗粒分析中，从多个二维（2D）投影图像中获得的数据被组合在一起，以产生生物结构的3D重建。使用单颗粒方法的最高分辨率是在对二十面体病毒进行成像时实现的。单颗粒成像的其他应用包括以10埃分辨率重建动态蛋白质复合物和分析构象异质性标本。

使用冷冻电镜的最新研究
最近，冷冻EMs被广泛用于收集蛋白质和其他分子结构的图像，并将其存储在电子显微镜数据库（EMDB）中，这是EM求解结构的流行存储库。这些结构有望用于鉴定蛋白质的工作原理，以及它们在疾病诊断和治疗中的作用。

Cryo-EM还用于识别2019年冠状病毒病（COVID-19）变体的结构变化，以了解病毒的进化，这增加了它们的传染性。采用高分辨率冷冻电镜检测β和α变异体刺突蛋白结构的变化。该研究发表在《自然通讯》杂志上。