扫描电镜样品的制备指南

扫描电子显微镜使用电子束而不是光束，使我们能够在纳米尺度上看到传统光学显微镜和图像结构的衍射极限以下。

虽然光很容易通过空气透射，但电子却不是。因此，为了使用扫描电子显微镜（SEM）对样品进行成像，必须将其暴露在硬真空中。

此外，如果不首先将非导电样品涂覆在导电层中，则对非导电样品进行成像可能很复杂甚至不可能，因为成像依赖于显微镜和样品之间的电子转移。

虽然SEM样品制备可能很复杂，但正确和仔细地执行以创建有意义和详细的图像至关重要。本指南提供了SEM样品制备的实用概述，从样品收集到成像点。

收集样本
与所有类型的显微镜一样，SEM成像的第一步是进行样品收集。

这里有许多典型的规则。当然，有必要确保所选样品代表所讨论的表面，散装材料或总体。

鼓励在样品收集之前和之后拍摄照片，以确保记录样品在自然状态下的样子。

样品收集的另一个重要方面涉及用于运输和样品储存的容器;它们的选择和处理方式必须保持样品受到保护并免受损坏。

样品制备被称为"清洁"过程，这仅仅意味着在从样品收集开始的每个阶段，都应该戴上手套。

确定所需准备水平
SEM样品制备中的两个主要决定因素是样品的水份含量及其刚度。

这些元素紧密相连可能并不奇怪：例如，硬质样品通常是干燥的（例如，复合材料或纳米线样品），1,2而软样品往往具有高水分含量（例如，细胞培养物或生物样品）。

脱水和固定
软物质样品，如活细胞小生物体和组织，在成像前需要固定和脱水。相反，干燥、坚硬的样品不需要大量处理，并且成像相对简单。

固定是用于对样品进行化学处理以保持和稳定其结构的术语。

固定通常通过使用在缓冲化学固定剂（如戊二醛，甲醛或单宁酸）中孵育来实现;随后通常使用四氧化锇进行固定后。4绕过此固定过程自然会导致脱水阶段的样品损坏。

样品在固定后可以冲洗和脱水。如果样品含有任何水分，则需要进行脱水：当暴露于显微镜内的高真空条件下时，所有样品必须不含水分。5

虽然使用风干或化学品脱水速度很快，但它并不一定能提供最佳效果。事实上，像这样的技术会影响样品的完整性并有损坏的风险，特别是在使用HMDS（六甲基二硅氮烷）等化学物质的化学主导的快速脱水的情况下。

临界点干燥（CPD）或冷冻干燥通常用于获得高质量的结果 - 这两种命名过程都通过绕过突然的液气相变来防止样品损坏。

临界点干燥（也称为超临界干燥）是一种高温、高压过程的名称，该过程允许液体平稳地转变为气体，而不会通过突然的相界。

在临界点，液体和气态之间的表面张力为零 - 因此可以从样品中除去液体而不会损坏它们。

水通常首先用乙醇或丙酮代替（通过将样品浸泡在一系列浓度增加的溶剂中），然后将其放入CPD机器中，因为它在其临界点具有高温并且不易与液体CO混溶2.
相对容易干燥样品并保持其作为CO的自然外观2在临界点（31.0°C）具有低温。

冷冻干燥是一个不太复杂的过程。冷冻干燥只需将给定的样品放入冷冻干燥机即可完成。在该机器内部，水首先被冻结，然后从固相升华到气相中。

冷冻干燥和CPD产生不同的结果。虽然CPD被认为对以高达约5000倍放大倍率成像的样品有效，但在此放大倍率之外通常可以看到可见的结构损坏。

鉴于液态一氧化碳2是一种强力溶剂，一些样品也可以被CPD中涉及的化学物质部分溶解。因此，这禁止使用CPD，CPD高度溶于CO。2.

但是，重要的是要注意，冷冻干燥不会导致样品的溶解，并且通常可以使用更高的放大倍率。当然，通常，冷冻干燥会产生分子伪影，如塌陷和聚集，可溶性元素可以在样品中重新定位。

在干燥后立即将样品移至干燥储存室至关重要，以防止环境水分积聚。

曝光、清洁和抛光
在揭示成像所需的表面时，该方法有三大类。具体如下：

动作，如压裂、切割和抛光，可以通过机械作用或电解过程（如电解抛光）执行
机械变薄或气载颗粒磨损
化学和物理处理，如化学变薄、化学抛光、等离子蚀刻或聚焦离子束（FIB）。等离子体蚀刻和FIB在显微镜本身内原位进行。
能量色散X射线光谱（EDS）等成像方式需要非常光滑的表面 - 这意味着抛光至关重要。

相反，对于普通的SEM来说，抛光不是必需的，普通的SEM旨在探测形态。所使用的放大倍率水平、成像特征的类型以及样品本身的属性决定了使用哪种技术。

氮气鼓风机或空气鼓风机是去除样品粉尘的有效方法。不建议使用"罐装空气"或"空气除尘器"进行SEM制备。此类产品可能会损坏样品，因为它们通常含有其他化学物质。

安装
关键是要确保在安装样品时在短截线和样品顶部之间进行导电接触。因此，如下图所示，当使用粘合剂时，必须有足够的使用量才能使连续的涂层层在样品和短截线之间架起桥梁。

虽然碳片和碳带可提供高达100，000倍放大倍率的实用性，但它们存在在SEM环境中产生释气或蠕变的风险。由于这些原因，不建议将其用于更高的放大倍率。采取这种预防措施可确保防止样品顶部的电荷积聚。

通常，对于粉末，使用一次性刷子将少量材料涂在一块碳带上就足够了。一把刷子通常就足够了，并且可以使用光学显微镜检查沉积在胶带上的材料量。

纳米颗粒应首先使用适当的溶剂（例如乙醇或异丙醇）溶解。建议您使用碳水泥将硅芯片安装到短截面上，然后彻底清洁。需要3-5微升的溶液液滴才能使样品分散良好。

溅射涂层